Destrukce jako princip řízení

Ti, kteří se zabývají bakteriemi, jistě souhlasí s tím, že regulace genové exprese na úrovni transkripce by nebyla účinná, kdyby molekuly mRNA neměly rychlý obrat. Jinak by totiž i po zastavení syntézy mRNA represorem ještě dlouho v buňce přetrvávala syntéza příslušného proteinu podle hotových molekul mRNA. Destrukce mRNA na prvočinitele je tudíž v tomto případě podmínkou účinnosti řízení. Ale destrukce se u prokaryotických organizmů může uplatnit při řízení ještě mnohem specifičtějším způsobem. Některé represory jsou z DNA uvolňovány tak, že se jejich přilnavost k DNA zeslabí připojením nízkomolekulárního efektoru. Někdy však lze umlčené geny rozezpívat jen tvrdým zásahem. Represory blokující transkripci např. skupiny genů, které se podílejí na procesech SOS, jsou doslova rozštípány specifickými proteinázami, když ultrafialové záření rozezvučí sirénu na poplach. Obrana vyžaduje speciální proteiny. Exkurze do říše eukaryotických organizmů nám ukáže, jak důmyslný a komplikovaný systém selektivní destrukce proteinů působí nejen v jednobuněčných kvasinkách, ale i v rostlinách, zvířatech, a dokonce i v nás, lidech.

Ub nemá nic společného s Jarryho králem Ubu. Je to malý protein, plným jménem ubikvitin, který obsahuje pouhých 76 aminokyselinových zbytků. Ub patří k dynastii molekulárních počišťovačů, kteří se specializují na odklízení proteinů v buňkách organizmů eukaryotické říše. V prokaryotické říši se Ub nevyskytuje, pokud tam ovšem není násilím zavlečen nějakým rozverným genovým inženýrem. Ub je největší, dosud známý „konzervativec“ mezi proteiny, což znamená, že jeho pořadí aminokyselin je stejné nebo téměř stejné u všech eukaryotických organizmů. Ani prostorové uspořádání polypeptidu, globule s vyčnívajícím ocáskem C-konce (viz obrázek), se v jednotlivých buňkách neliší, pokud ovšem není Ub součástí většího celku, což se stává často např. hned při „narození“.

Tak jako většina slušných proteinů je i Ub kódován sekvencí nukleotidů v DNA. Pekařská kvasinka Saccharomyces cerevisiae obsahuje např. hned čtyři geny UBI 1, 2, 3 a 4, které zahrnují kompletní informaci pro Ub, ale ve všech případech jsou to geny zvláštní, protože kódují proteinová dvojčata (UBI 1, 2 a 3), anebo dokonce paterčata (UBI 4). V trojici „siamských dvojčat“ na Ub navazuje vždy jiný ribozomální protein a paterče tvoří pět stejných Ub pěkně za sebou svázaných peptidickými vazbami (viz obrázek). K oddělování Ub dochází tudíž až po narození proteinového prekurzoru zákrokem, na kterém se podílejí „molekulární chirurgové“ kódovaní rodinou genů UBP. Jsou to proteinázy, karboxyterminální hydrolázy, schopné „specificky přestřihnout“ právě jen hraniční peptidickou vazbu vedle Ub. Dvojčata „se rodí“ plynule. Však také dodávají Ub pro běžné potřeby za fyziologických podmínek. Spojením Ub s ribozomálními proteiny je zajištěno sladění mezi tvorbou ribozomů a tím i výkonem proteosyntetického aparátu v buňce a ubikvitinylací proteinů, které mají být odbourány za normálních podmínek. Čím více proteinů vzniká na ribozomech, tím více jich musí být později degradováno. Produkce paterčat se zvyšuje pouze za stresových podmínek, když je třeba odstranit mnoho nepovedených proteinů. Zvýšením exprese jediného genu UBI 4 se tudíž dosáhne obrovského zrychlení přísunu Ub jen pro zvláštní účely, což je nejen vtipné, ale i úsporné.

Letos o prázdninách jsem prokládal četbu publikací o ubikvitinovém systému dlouhými procházkami smíšenými lesy Lužických hor a tak není divu, že se mi propojilo zdánlivě nepropojitelné. Když stromy rostou příliš hustě, je třeba je prořezat. Když je některý napaden škůdcem, listy se pokroutí nebo jehličí zežloutne a opadá. Funkce stromu zaniká. I takový strom je třeba odstranit. Některé stromy se musí pokácet, když je skladba lesa nevyhovující. Nejdříve přijdou lidé, kteří odsouzené stromy označkují, a potom další se sekerami a pilami, aby dokonali dílo. Z označených stromů zůstanou osekané větve a špalky. Něco se odveze jinam k dalšímu zpracování, něco zůstane na místě a postupně se rozloží na jednoduché sloučeniny, které se vtělí do nových výhonků. Řízená destrukce jednotlivých stromů udrží les ve formě. Stromy jsou jako buněčné proteiny. Ub je značkou na tělech přebytečných anebo poškozených proteinů. Značka si sama nevybere svůj strom, ani na něj sama neskočí. V pozadí je složitý systém pravidel a pomocníků, stejně jako za značkováním proteinů určených k degradaci. Specificky značkovat protein k degradaci znamená rozeznat jej a připojit k němu Ub kovalentní vazbou. Příroda vyřešila tento úkol ve třech oddělených krocích.

Prvním z nich je probuzení Ub dodáním energie potřebné k vytvoření kovalentní vazby (obrázek a), a to bez ohledu na konečného specifického adresáta, produkty genu UBA. Energie se získává hydrolýzou ATP. V druhém kroku se aktivovaný Ub (Ub*) připojí k některému z enzymů, kódovaných rodinou genů UBC (obr. obrázek a), které zajistí specifický přenos Ub na určitý protein anebo typ proteinů. Těchto enzymů bylo např. u pekařské kvasinky objeveno zatím 11, což naznačuje, že mohou rozlišit 11 typů proteinů. To by ale nestačilo. Nároky na rozlišení jsou větší. Některé konjugující enzymy rozeznávají cílový protein přímo a jiné zprostředkovaně za účasti rozeznávacích faktorů, produktů genů rodiny UBR. Tyto proteiny se vážou slabými vazbami na cílové proteiny. Specifita rozlišení se násobí tím, že určitý Ubcprotein rozeznává určitý Ubr-protein, který rozeznal určitý cílový protein nebo skupinu proteinů. Při aktivaci se Ub neváže na Uba peptidickou vazbou, ale vazbou tioesterovou (obr. obrázek a), stejně jako na konjugační enzymy (Ubc). To, že nějaký enzym patří k týmu přenašečů, se snadno pozná, neboť se více či méně navzájem podobají v rozsáhlé oblasti své molekuly. Zejména v některých částech, mezi které patří také okolí cysteinu, na nějž se Ub váže karboxylovou skupinou C-koncového glycinu. Základní akce, převzít Ub z Uba a přenést jej na aminokyselinu postranního řetězce lyzinu adresáta (obrázek c), je ve všech případech stejná, takže podobnost mezi sourozenci nepřekvapuje. Rozdíly mezi jednotlivými Ubc jsou však dostatečné na to, aby rozlišení konečných adresátů bylo za případné pomoci Ubr naprosto jasné. Příklad z oblasti lesního hospodářství přeci jen nevystihuje všechny možnosti ubikvitinového systému. Jeho specifita dovoluje mnohem cílenější zásahy do proteinového hospodářství, než je pouhé odstraňování nepotřebných nebo poškozených proteinů (viz Z. Storchová: Vesmír 74, 554, 1995/10). Nastavení poločasu rozpadu regulačních proteinů má pochopitelně charakter řídícího procesu. Ubikvitinylován může být dokonce i sám Ub (obrázek d), a to na svém lyzinu v poloze 48. Takto vzniká multiubikvitin neboli multiUb (obr. obrázek e), který se uplatňuje při multiubikvitinylaci.

Pořádek v systému je obdivuhodný. Každý druh složených molekul obsahujících Ub nese pásku speciální vazby – peptidickou vazbu pro připojení Ub v prekurzorech (obrázek), tioesterovou vazbu (obrázek a) pro aktivátory a přenašeče, a nakonec izopeptidickou vazbu (obrázek b) na cílový protein, který je tak modifikován, nebo dokonce odsouzen k degradaci. Monoubikvitinylace je zásahem modifikačním. Protein změní vlastnosti, ale není degradován a může být ubikvitinové značky dokonce zbaven. Monoubikvitinylaci zajišťují přímo některé Ubc. Multiubikvitinylované proteiny jsou odsouzeny do stoupy. Na tomto procesu se podílejí Ubc v součinnosti s Ubr.

Odsouzenec do stoupy se pozná podle toho, že nese multiubikvitin. Jak ale poznal Ubr nebo Ubc, že měl právě tento protein ocejchovat? Jen v některých případech víme a jindy jen tušíme, jak taková značka na proteinu vypadá. Někdy je poukázkou na multiubikvitinylaci druhá aminokyselina za metioninem, který je v určitém počtu případů odstraněn. Aby se druhá aminokyselina stala značkou, musí být někdy ještě upravena. Takovýmto způsobem rozeznává proteiny podle zákona N-koncové aminokyseliny Ubr 1 v S. cerevisiae, který spolupracuje s Ubc 2. Jindy je protein rozeznán podle určité vnitřní sekvence aminokyselin, která může být od začátku vystavena, nebo je ukryta a objeví se jen u nesprávně sbalených proteinů. Na tomto principu se pravděpodobně odbourávají nesprávně sbalené proteiny. Jindy může značka vyplavat na povrch až po modifikaci proteinu např. fosforylací. Tak může být regulace modifikací spřažena s regulací pomocí destrukce. Není vyloučeno, že jistou roli by mohlo hrát i vystavení lyzinu vhodného pro ubikvitinylaci.

Bazické proteiny jsou rozeznávány přímo „kyselým“ ocáskem některých Ubc, ale v těchto případech dochází k monoubikvitinylaci a protein je pouze modifikován.

Při mých občasných cestách do zahraničí mne okouzlil jeden nenápadný přístroj, který seděl na dně výlevky v mnoha kuchyních. Výkonný mlýnek, brána do kloaky města. Slupky z brambor, zeleninový odpad, a dokonce kosti mizely v hladové tlamě, aby se proměnily v drobný šrot. V každé eukaryotické buňce se nacházejí zvláštní útvary, jejichž elektronověmikroskopické snímky připomínají patafyzické stroje. Podivné roury zakryté na obou koncích čepičkami. Typové označení, proteazom 26S, svědčí o tom, že to není něco neužitečného. Je to buněčný degradátor proteinů, blízký příbuzný kuchyňského drtiče. Místo rotujících nožů jsou v proteazomu enzymy, které katalyzují hydrolýzu peptidických vazeb. Do nálevky proteazomu proudí jen proteiny multiubikvitinylované (obrázek). O to je proteazom „chytřejší“ než mlýnek na odpad, který roztrhá všechno, co spadne do jeho jícnu.

Z molekulární řitě proteazomu vycházejí oligopeptidy (oligo P), a hle, další překvapení! Ub zůstal neporušen, zacpává průchod navěšen na lyzinu, který s sebou vleče i své okolí z označkovaného proteinu. A potom střih, izopeptidická vazba praská a Ub se uvolňuje za pomoci jednoho člena rodiny Ubp. Karboxyterminální hydroláza Ubp4 alias Doa4 je součástí komplexu proteinů vytvářejících proteazom. Zabraňuje jeho „ucpání“. Ub se může vrátit do víru značení dalších proteinů. Nespotřebuje se v jednom cyklu. Šetří se materiálem i energií.

Celkový pohled na zjednodušené schéma „proteinové kanalizace“ v eukaryotické buňce (obrázek) ukazuje, že jednotlivé pomyslné stoky jsou důmyslně větvené a ne všechny ústí do jícnů „proteinových drtičů“. Proteosyntetický aparát chrlí proteiny podle instrukcí uložených v jednotlivých mRNA. Proteiny putují na místa určení, kde vykonávají své funkce katalytické, regulační, transportní, stavební, receptorové aj., a to někdy až po určité úpravě a tak dlouho, dokud nejsou degradovány.

Čtenář tohoto článku si patrně v tomto místě pomyslí, že toho povyku okolo „proteinové kanalizace“ bylo až dost. Stávka počišťovačů by sice mohla být nepříjemnější než stávka třeba železničářů, ale ani v jednom případě snad nejde o život. Jenomže v tom je právě ten háček. Experimenty s kvasinkovými mutanty naznačují, že ubikvitinový systém má slabá místa. Poškození genu UBA1, které vede ke ztrátě schopnosti aktivovat Ub, je např. smrtelné, stejně jako porušení některých genů kódujících součástky proteazomu. Jen díky tomu, že genů rodiny UBI, UBC a UBP je větší počet a funkce některých jejich produktů se alespoň do určité míry překrývají, je ubikvitinový systém částečně zajištěn proti tomu, aby nebyl jedinou mutací v jednom z těchto genů zcela vyřazen z provozu. Ale i tak jsou tyto mutanty většinou viditelně „nemocné“, špatně rostou anebo jsou méně odolné k působení určitých nepříznivých vlivů.

Studium ubikvitinového systému u kvasinek ukázalo, že jednotlivé UBC a UBR hrají významnou a více či méně specifickou roli při řízení a kontrole mnoha základních buněčných pochodů, jakými jsou např. buněčný cyklus, sporulace, přechod do stacionární fáze, opravy, mutageneze a rekombinace DNA, adaptace na změny růstových podmínek, reakce na stresové podmínky, transkripce a translace. U mnohabuněčných organizmů včetně člověka jsou navíc poruchy funkce ubikvitinového systému provázeny změnami řízené proliferace, diferenciace, programované smrti buněk a funkce nervového a imunitního systému, což může mít za následek řadu závažných onemocnění nebo i smrt celého organizmu. U řady lidských neurodegenerativních chorob, jako je např. Alzheimerova choroba, nebo autoimunitních onemocnění, jako je např. lupus erythromatosus, bylo zjištěno, že jsou provázeny výraznými změnami v ubikvitinylaci proteinů. Nelze však prozatím rozhodnout, zda tento jev je příčinou onemocnění, anebo průvodním příznakem. Intenzivně se studuje i význam ubikvitinylace produktů protoonkogenů, onkogenů a antionkogenů v souvislosti s uvolňováním proliferační aktivity buněk až do fáze maligního metastázujícího karcinomu. Těmito poznámkami v žádném případě nechci vzbudit dojem, že vědecké expedice do království molekulárních počišťovačů konečně vyřeší zásadní problémy, jako jsou obrana organizmů proti nepříznivým vlivům prostředí, vznik rakoviny, anebo jak nestárnout. Chci pouze na příkladu ubikvitinového systému ukázat, že zákonitosti destrukce proteinů jsou pro pochopení příběhu o řízení základních životních procesů stejně důležité, jako zákonitosti jejich produkce a modifikace.

Proteiny mají mezi biopolymery výsadní postavení aktivních vykonavatelů řady funkcí, mezi které snad na prvním místě patří řízení jednotlivých životně důležitých pochodů. Bez enzymové katalýzy by neproběhla téměř žádná metabolická reakce, bez proteinů–přenašečů by nebylo směrovaného specifického přenosu různých sloučenin, bez regulačních proteinů by v buňce nastal chaos, a to dokonce i v syntéze samotných proteinů. Hladina funkčního proteinu je nastavována nejen rychlostí destrukce, ale hlavně rychlostí jeho syntézy a také rychlostí různých modifikací, které mohou protein aktivovat nebo inaktivovat (obrázek). Aktivace může být někdy totožná s úpravou, kterou je částečná destrukce nefunkčního prekurzoru. Vzpomeňme na trypsinogen, u kterého musí být část molekuly odstřižena, aby vznikl funkční proteolytický enzym trypsin. Pochopitelně syntéza proteolytického enzymu umožní destrukci jiných proteinů. Konstrukce, modifikace a destrukce proteinů jsou vzájemně neoddělitelné. Rychlost syntézy proteinů závisí na výkonu proteosyntetického aparátu a ten na přísunu mRNA, a ten na množství a zastoupení příslušné mRNA, a tady se refrén písničky o destrukci opakuje, neboť množství určitého mRNA závisí mj. na rychlosti syntézy jejího prekurzoru, rychlosti jeho modifikace a rychlosti destrukce hotové mRNA (Vondrejs V., Biologické listy 60, 293, 1995).

Polysacharidové sítě jsou hlavní součástí nadmolekulárního útvaru, buněčné stěny, která ohraničuje řadu buněk různých druhů jednobuněčných i mnohobuněčných organizmů. Množení takových buněk je intimně spojeno právě s růstem této vnější ohrady. Jak ale přistavovat zeď, která nemá začátek ani konec? Jediná možnost je trochu ji rozbít a nové stavební kameny vkládat do rozvolněných míst. I tady je spojení konstrukce a destrukce neoddělitelné a způsob destrukce a vkládání bude určovat tvarové proměny povrchu.

Destrukce jaderné blány předcházející jadernému dělení u většiny eukaryotických organizmů, neustávající přestavba skeletu buňky, změny výstavby chromatinu v průběhu buněčných a životních cyklů a rozpad ribozomů na podjednotky na závěr translačního cyklu, to jsou další příklady z řady procesů spojených s destrukcí nebo částečnou destrukcí nadmolekulárních útvarů.

Caenorhabditis elegans je hlístice, která se proslavila ani ne tak svou elegancí, jako spíše proto, že její růst do kompletního organizmu obsahujícího celkem 1090 buněk byl opravdu krok za krokem zmapován. O každé její tělní buňce se ví, jak postupně vznikala dělením. Navíc bylo však zjištěno, že v průběhu růstu zahynulo 131 určitých buněk. Tento proces označovaný jako apoptóza, který vede k programované destrukci určitých buněk, je kontrolován asi 14 geny. M. O. Hengartner (Science 270, 931, 1995) obdržel mezinárodní cenu pro mladé vědce, když ukázal, že jeden z genů, ced 9, kóduje negativní regulátor tohoto procesu. Mutace vedoucí k inaktivaci produktu způsobí, že hynou i jiné buňky, mutace vyvolávající zvýšenou expresi tohoto genu má za následek, že nehyne nic. Tento příklad ukazuje, že refrén o spojení konstrukce (růst a dělení buněk), modifikace (diferenciace buněk) a destrukce (apoptóza) lze zazpívat i v souvislosti s vytvářením těl mnohobuněčných organizmů. Jedním z nejprimitivnějších společenstev jednobuněčných organizmů je kolonie, která připomíná do určité míry primitivní mnohobuněčný organizmus. Na obrázku a je zaznamenán osud kolonie za podmínek specifické limitace růstu nedostatkem uracilu v médiu. Po určité době hladovění se na povrchu kolonie začnou objevovat malé nádory buněk, které pokračují v dělení, i když základ kolonie růst zastavil. Na těchto nádorech posléze vznikají druhotné nádory atd. Květákovitý povrch kolonie vzniká v důsledku kanibalistického růstu buněk, které přežily, na buňkách, které zahynuly během hladovění a jejich lyzí se uvolnil jejich vnitřní obsah včetně potřebného uracilu. Jiný kmen, který nehyne, anebo tentýž kmen, jehož lyzi bylo zabráněno přidáním 1M sorbitolu, vytváří kolonie hladké (obrázek b). Proces konstrukční, vytváření nádorů na povrchu kolonie, vyžaduje destrukci většího počtu buněk. Význam destrukce při vývoji společenstev vyšších organizmů je tak zjevný, že jej není třeba připomínat. Pozorný čtenář si jistě všiml, že termín destrukce byl v tomto článku používán ne ve smyslu následku dopadu atomové bomby, ale spíše jako to, co pozorujeme při demolici řadového domku pyrotechnikem, který si dá záležet na tom, aby v okolních domech pokud možno ani nedrnčely okenní tabulky. Prostě mluvili jsme o vysoce specifické, opatrné, plánovité destrukci, kterou by snad bylo možno označit jako destrukci konstruktivní.