Mikrobiální biofilm
O existenci bakterií v přírodě se ví všeobecně a také je všeobecně známo, že se bakterie pěstují na živných půdách ve skleněných nebo plastikových miskách. Rostou v malých kopečcích, jimž se trefně říká kolonie. Jak také jinak, když tímto způsobem bakterie kolonizují území, které jim pěstitel přidělil. Než však Robert Koch přišel na způsob jak pěstovat bakterie na pevných půdách, pěstovaly se po několik let v tekutinách, nejčastěji v bujonu. V něm se volně vznášely, plavaly a množily se, nebyl ale znám způsob jak je od sebe oddělit. To umožnily až Kochovy agarové půdy, díky nimž se dala získat čistá kultura a mohl začít zlatý věk bakteriologie. Ten byl naplněn studiem morfologie, fyziologie a genetiky bakterií – a vírou, že výsledky studia prozradí o bakteriích vše.
Překvapivě věrně kopírovala bakteriologie cesty počátků zoologie až na to, že se kabinety bakteriologů neplnily vycpanými bakteriemi. Bakterie byly hodnoceny podle toho, co o nich mikrobiolog zjistil ve své malé zoologické zahradě. Změřil je, namaloval, vyfotografoval, prozkoumal jejich metabolizmus. Stejně tak to dělali ostatní přírodozpytci, kteří studovali zvířata v zajetí. Nikoho nenapadlo, že by bakterie ve své přirozenosti žily jinak než jako plankton volně se vznášející v mořích nebo jako kolonie na výživné podložce. Chování bakterií v jejich přirozeném prostředí se prostě předvídalo podle výsledků výzkumu čistých kultur.
Z nedostatku pochyb o dogmatech upadla bakteriologie do pasti a ocitla se na scestí, což ovšem není tak vzácné. Dlouho platilo, že v žaludku člověka a jiných savců bakterie nemohou žít, protože je tam velmi kyselé prostředí (dnes víme nejméně o tuctu druhů, které v žaludku bývají). Také se nepředpokládalo, že by se některé bakterie mohly významně pomnožit v amébách jako legionely (gramnegativní nepohyblivé bakterie vyvolávající onemocnění dýchacího a cévního systému) nebo že se mikrob náročný na kultivační půdu nemůže přirozeně množit v chudém prostředí. Překvapení poskytly opět legionely. Trvalo dlouho, než jim podle rafinovaně sestaveného a kuriózního receptu mohla být nabídnuta bohatá kultivační půda, na jiné totiž nerostou. Přitom se ale dají snadno získat – z rezavé vody, kterou je naplněno ústřední topení.
V čem spočívá scestí, jež se tu poněkud dramaticky líčí? Dlouho nikoho ani nenapadlo pátrat po tom, jak žijí bakterie v přirozeném prostředí. Žije každá buňka sama pro sebe, nebo je ovlivňována ostatními a sama ovlivňuje druhé? Uplatňuje se už i u bakterií nějaký systém funkční diferenciace? Díky své fenotypové přizpůsobivosti představují bakterie nejúspěšnější formu existence života na Zemi. Mohou žít buď volně ve vodním prostředí jako plankton, nebo ve společenství, které vytváří tenkou vrstvu na pevných tělesech – biofilm.
Ukazuje se, že existence v biofilmu je pro bakterie z mnoha důvodů výhodnější a ve většině prostředí také je základním způsobem jejich přirozené existence. V přírodě mají bakterie přirozenou tendenci lepit se, přilnout na pevný povrch. Přirozené tekuté prostředí pro bakterie jsou potoky, řeky, oceány, ale i odpadní vody, žumpy a průmyslové organické odpady. Zde všude biofilm přináší problémy, neboť přinejmenším znečisťuje povrch, na němž se tvoří, a někdy jej i chemicky poškozuje korozí. Zvětšuje například odpor lodního trupu při plavbě a poskytuje základ pro usazování řas a mušlí. V trubkách biofilm způsobuje turbulenci protékající tekutiny, černání kovů redukovaným železem nebo hnědnutí manganem. Podílí se také na korozi ropovodů či nádrží paliva v letadlech. V průmyslových výměnících tepla tvoří tepelnou izolační vrstvu a snižuje jejich účinnost. Zmenšuje průsvit potrubí pitné vody.
Vhodné podmínky pro tvorbu biofilmu jsou také na cizích tělesech v lidském těle, jako jsou kanyly, katétry či plastikové protetické implantáty, kde bakterie mohou ohrozit léčbu, a tím i zdraví. Na druhou stranu biofilm střevní sliznice tvořený saprofytickými a symbiotickými bakteriemi člověka do jisté míry chrání před nevhodnými mikroby – i před patogeny.
Z pozorování a měření byl vytvořen model architektury a funkce biofilmu. Bakterie jsou v něm rozloženy nerovnoměrně, rostou v mikrokoloniích, shlucích bakterií kuželovitého nebo houbovitého tvaru. Mikrokolonie jsou spojeny spletitými kanálky. Většími mikrokoloniemi kanálky procházejí, jsou však tenčí, představují jakési póry. Na povrchu je biofilm omýván okolní kapalinou obsahující molekuly živin. Ta proniká i do biofilmu a póry se dostává až do nitra mikrokolonií. Biofilm jediného bakteriálního druhu má jednodušší stavbu než biofilm obsahující společenství více druhů. Značná část experimentálního zkoumání byla prováděna s kulturami Pseudomonas aeruginosa.
Kapalina, která biofilm omývá zvenčí, přináší zužitkovatelné organické i anorganické látky a odnáší produkty metabolizmu. Do hloubky jsou – stejně jako kyslík – zanášeny již zmíněným systémem kanálků. Lze v nich pozorovat proudění, a dokonce byla změřena hydrodynamika protékající tekutiny. Kanálky mají poměrně velký průsvit, proudem tekutiny jsou snadno unášeny částice latexu o průměru 0,3
Jestliže se má biofilm vytvořit, je nutné, aby se v nových podmínkách užívaly nové nástroje. Zejména se musí vytvořit matrice, v níž budou buňky usazeny. Matrici tvoří polysacharid nebo (u již zmíněné Pseudomonas aeruginosa) hlenovitý polymer alginát. Ten je syntetizován řadou enzymů určených několika po sobě spouštěnými geny. Je-li do řady experimentálně vložen další gen, jehož produkt způsobuje dobře patrnou reakci, pak je míra jeho aktivity stejná jako aktivita genů v dráze syntézy alginátu a ukazuje dynamiku syntézy. Takový indikační gen například způsobuje modré zbarvení v přítomnosti laktózy. Alginát je intenzivně syntetizován v neobvyklé míře již za 15 minut po přilnutí bakterie na povrch.
- Chemické signály. V husté populaci používají buňky chemické signály, jimiž upozorňují okolní buňky na svou přítomnost. Je to určitá forma boje o území. Signální látky jsou jednoduché molekuly složené z mastné kyseliny a aminokyseliny serinu. U grampozitivních mikrobů jsou to peptidy, jež lze přirovnat k feromonům nebo hormonům. Řídí dělení buněk, a tím hustotu populace v biofilmu a tvorbu hlenové matrice. Byly prokázány v přirozeném prostředí – na říčních kamenech potažených biofilmem a na močových katétrech zavedených do močového měchýře na delší dobu. Signální látky lze prokázat i na místě, odkud byl biofilm odstraněn.
Mutanty v genu, který ovládá tvorbu signálních molekul, vytvářejí nepovedený tenký nediferencovaný biofilm a buňky jsou mnohem citlivější k detergentům. Jestliže se jim přidá uměle syntetizovaná signální látka, tvorba biofilmu je normální. Signální látky tvořené bakteriemi působí na týž druh, některé ale na mnoho příbuzných druhů. Jejich účinek je tedy dobře jištěn.
- Geny odpovědné za signály. Genů tvořících komplexní systém signálů o přítomnosti buněk je několik desítek. Bílkoviny, jež jsou těmito geny určovány, mají ale více funkcí. Kromě regulace se uplatňují také faktory virulence, toxiny a enzymy, jež sepodílejí na rozvoji infekce. Pravděpodobně způsobují jistou fenotypovou diferenciaci, protože jinak by se buňky na povrchu mikrokolonií, které mají snazší přístup k živinám, množily více a zcela by ucpaly póry. Přísun živin do nitra by ustal a buňky uvnitř by hynuly. Tato úvaha zatím není experimentálně prokázána. Je však jasné, že populace v biofilmu je pod přísným regulačním režimem.
- Přenos genů mezi buňkami v biofilmu je až tisíckrát úspěšnější než přenos v kapalině mezi buňkami žijícími planktonicky.
- Fenotyp buněk v biofilmu se rytmicky mění. Aktivací genu pro syntézu enzymu, který matrici štěpí, se buňky ze společenství uvolňují, odplavují se, popřípadě kolonizují další povrch. Po nějakou dobu si však zachovávají některé vlastnosti, které měly v biofilmu, jako třeba vyšší rezistenci k antibiotikům.