Genetika esenciální hypertenze
Statistické údaje Světové zdravotnické organizace řadí Českou republiku na jedno z předních míst v úmrtnosti na choroby srdce a cév, muži byli na čtvrtém a ženy na osmém místě z 38 sledovaných zemí. Za jeden z hlavních rizikových faktorů mozkové mrtvice, infarktu myokardu a selhání ledvin je považován vysoký krevní tlak, který se tak významně podílí na zvýšené nemocnosti a úmrtnosti našeho obyvatelstva. V letech 1988 a 1992 byla v České republice provedena populační vyšetření nejvážnějších rizikových faktorů onemocnění srdce a cév a zjistilo se, že v průběhu těchto čtyř let se významně zvýšily průměrné hodnoty diastolického krevního tlaku. Že nejde o zanedbatelný varovný signál, ukazují americké populační studie, podle nichž u jedinců s krevním tlakem vyšším o pouhých 5 mm Hg vzrůstá téměř o 30 % riziko mozkové mrtvice a téměř o 20 % riziko infarktu myokardu.
Vysoký krevní tlak je uměle definován na základě zvýšeného diastolického krevního tlaku (obvykle nad 90 mm Hg, viz obrázek), i když u některých, zvláště starších jedinců, může být zvýšený jen systolický krevní tlak (nad 160 mm Hg). Jak název esenciální napovídá, příčiny hypertenze nejsou známy. Genetické studie ukázaly, že normální úroveň krevního tlaku je podmíněna mnoha geny malého účinku, jejichž efekty jsou navíc modifikovány faktory prostředí. Podobně je podmíněná i esenciální hypertenze. Relativně vzácně se u člověka vyskytují formy hypertenze podmíněné změnou (mutací) jednoho genu velkého účinku, tedy monogenně. Příkladem ″monogenní hypertenze″ je familiární hyperaldosteronizmus, kdy ke zvýšení krevního tlaku vede nadprodukce aldosteronu, způsobená mutací genu pro jeho syntézu. U takovéto monogenní formy hypertenze mají všichni postižení jedinci výše zmíněnou mutaci, a protože tak existuje dobře definovaný vztah mezi abnormálním genem a hypertenzí, označuje se pak takový gen jako “nezbytný″ pro vývin choroby. Pro většinu nemocí (včetně esenciální hypertenze) však není takovýto přímý vztah mezi genotypem a fenotypem zřejmý. Zkoumá-li se pak účinek určitých genů na regulaci krevního tlaku, obvykle se zjistí, že ne všichni jedinci s vysokým krevním tlakem nesou “hypertenzní″ alelu (variantu) daného genu a naopak, že ne všichni kontrolní jedinci s normálním krevním tlakem nesou “normotenzní″ alelu.
Protože tedy neexistuje přímý vztah mezi specifickými alelami a krevním tlakem, byla navržena hypotéza, že esenciální hypertenze je podmíněna nikoliv “nezbytnými″, ale spíše “predisponujícími″ geny, které riziko vývinu hypertenze pouze zvyšují. Odhalení takovýchto “predisponujících″ genů je ovšem velmi obtížné. Studium zvířecích modelů esenciální hypertenze ukázalo, že ne veškerá variabilita v krevním tlaku populací pokusných zvířat je podmíněna společnými efekty mnoha ″predisponujících″ genů s malými účinky, ale že se uplatňují i výraznější efekty “nezbytných″ genů. To je povzbudivé, protože zřetelné fenotypové projevy genů jsou základní podmínkou pro jejich odhalení. Předpokládá se, že způsob, jak genová výbava určuje krevní tlak (a tím i esenciální hypertenzi) u lidí, by mohl být srovnatelný. Pro odhalení genů odpovědných za vysoký krevní tlak se u člověka nejčastěji používají dvě metody – asociační a vazebné studie.
- esenciální hypertenze je předpokládaně geneticky heterogenní, tzn. že i v rámci jedné rodiny mohou mít jedinci zvýšený krevní tlak z různých genetických příčin,
- je prakticky nemožné získat srovnatelné údaje o hodnotách krevního tlaku jedinců z několika následných generací,
- někteří jedinci v rodokmenu mohou mít “predisponující″ alelu, aniž by měli hypertenzi, což by mohlo vést k chybné interpretaci vazebné analýzy.
Využívají se proto odlišné strategie, z nichž nejjednodušší je studium párů hypertenzních příbuzných, nejčastěji sourozenců. Při vazebné analýze se pak zjišťuje, zda páry příbuzných s esenciální hypertenzí sdílejí původem identické alely vybraných kandidátních genů častěji, než by odpovídalo náhodě. Ve srovnání s rodokmenovými studiemi nemají analýzy hypertenzních příbuzných tři výše zmíněné nedostatky, nevýhodou je ale nižší statistická síla takovýchto testů ve srovnání s klasickými metodami analýzy vazby. Statistická síla těchto testů je totiž závislá hlavně na tom, jak daná alela zvyšuje riziko onemocnění u příbuzných ve srovnání s rizikem, jemuž je vystavena celá populace. V moderních společnostech má esenciální hypertenzi až 25 % obyvatelstva středního věku (obrázek). Má-li navíc daný jedinec sourozence s vysokým krevním tlakem, zvyšuje se dále riziko, neboť se svými sourozenci může sdílet i geny podmiňující vývin hypertenze. Protože však dědičnost esenciální hypertenze je poměrně nízká, není riziko, jemuž je vystaven jedinec s hypertenzními příbuznými, podstatně vyšší než riziko, jemuž je v průměru vystavena celá populace. V takovém případě je statistická síla vazebného testu poměrně malá. Vazebné studie ukázaly na možnou účast následujících kandidátních genů při vývinu esenciální hypertenze: gen pro angiotenzinogen, geny hlavního histokompatibilního komplexu, gen pro angiotenzinogen konvertující enzym aj. Podobně jako v případě asociačních analýz, i tyto výsledky je zatím nutno považovat za předběžné. Vážným problémem genetických analýz u lidí je i fakt, že se často nepoužívají aktuální hodnoty krevního tlaku hypertoniků (většinou pro komplikace s vysazením antihypertenzní léčby) a skupiny s vysokým a normálním krevním tlakem jsou vytvořeny uměle; pak se do “hypertenzní″ skupiny zahrnují jedinci s diastolickým tlakem v širokém rozmezí, např. od 90 do 130 mm Hg (obrázek). Takto nepřesně definovaný fenotyp může značně kompromitovat výsledky genetických analýz.
Rekombinantní inbrední kmeny
Schéma produkce rekombinantních inbredních (RI) kmenů je uvedeno na obrázku. Při produkci RI–kmenů se vychází ze dvou odlišných inbredních kmenů. Jejich křížením jsou získáni hybridi F1 (tj. 1. filiální, dceřiná generace) a dalším vzájemným párováním hybridní populace F2. U výchozí F2–populace dochází (v důsledku volné kombinovatelnosti otcovských a mateřských chromozomů a rekombinací při zrání pohlavních buněk) k tak obrovské genové variabilitě gamet, že téměř každý F2–hybrid má neopakovatelnou kombinaci rodičovských genů. Sourozeneckým křížením F2–hybridů po 20 a více po sobě následujících generací jsou však tyto jedinečné kombinace genů zafixovány. Systém RI-kmenů tak spojuje výhody segregace genů a inbrídingu: ve srovnání s F2–hybridy, jejichž genotypy jsou vždy jedinečné, a tedy při opakovaných kříženích téměř nereprodukovatelné, je možné z každého RI-kmene opakovaně získávat zvířata se stejnými genotypy. Takto je možné daleko přesněji stanovit fenotypy kvantitativních znaků RI-kmenů, ve srovnání s jedinci F2. To je velmi důležité zvláště u takových znaků, jako je krevní tlak, protože i u inbredních (geneticky stejných) zvířat se mezi jedinci obvykle pozoruje značná variabilita krevního tlaku. Porovnáním skupin RI-kmenů rozdělených podle alel specifických genů lze analyzovat asociace těchto genů s krevním tlakem nebo jinými znaky.
Rekombinantní inbrední (RI) kmeny pro genetickou analýzu spontánní hypertenze byly vytvořeny v našich laboratořích ve Fyziologickém ústavu AV ČR a v Biologickém ústavu 1. Lékařské fakulty Univerzity Karlovy. RI-kmeny byly odvozeny od spontánně hypertenzních potkanů kmene SHR a potkanů s normálním krevním tlakem kmene BN (Brown-Norway). Po dosažení 20 generací sourozenecké plemenitby bylo možné začít s prvními genetickými studiemi. Zpočátku se analyzoval vliv vybraných kandidátních genů na krevní tlak: statisticky významné asociace byly detegovány na chromozomu 4 s genem podobným kalikreinu, na chromozomu 13 s reninovým genem a na chromozomu 20 s genem ve vazbě s hlavním histokompatibilním komplexem (krevní tlak byl stanoven ve spolupráci s dr. J. Kunešem z Fyziologického ústavu AV ČR). V současné době jsou RI-kmeny typizovány ve více než 500 genetických signálních znacích – markerech (morfologických, imunogenetických, biochemických a molekulárněbiologických polymorfizmech). Genetické signální znaky tak pokrývají většinu genomu RI-kmenů, což umožnilo provést i tzv. poziční klonování genetických determinant krevního tlaku. Při tomto postupu není nutné mít o genech nebo jejich produktech žádné předběžné znalosti, odpovědné geny jsou vyhledávány pomocí vazeb s genetickými signálními znaky. Takto byly detegovány geny asociované s krevním tlakem na chromozomech 1, 2, 4, a 19.
Výsledky získané pomocí vazebných analýz, včetně RI-kmenů, představují opět jen předběžné, i když nezbytné studie, protože rozdíly v krevním tlaku mohou být ve skutečnosti způsobeny hemodynamickými efekty genů, které jsou ve vazbě s danými genetickými markery. Pro přesné zmapování odpovědných genů je proto třeba použít jiné přístupy, např. analýzu kongenních kmenů.
Kongenní kmeny
Hlavní limitací existujících zvířecích modelů esenciální hypertenze je skutečnost, že se od svých normotenzních kontrol liší nejen v genech determinujících krevní tlak, ale i v řadě dalších genů. Kongenní kmeny jsou naopak geneticky identické s rodičovským kmenem s výjimkou kratšího úseku jednoho, tzv. diferenciálního chromozomu. Kongenní kmeny jsou obvykle získávány osmi a více generacemi zpětného křížení, v každé generaci jsou do chovu vybíráni heterozygoti nesoucí diferenciální chromozomální úsek (obrázek). Jako příklad lze uvést vytvoření kongenního kmene, odvozeného od rodičovského kmene SR (rezistentního k soli v potravě), přenesením úseku chromozomu 13 s reninovým genem z kmene SS (citlivého k soli v potravě). Porovnáním obou kmenů bylo zjištěno, že kongenní kmen má nižší krevní tlak ve srovnání s rodičovským kmenem SR, zároveň byla u kongenního kmene pozorována redukovaná exprese (aktivita) reninového genu a snížená koncentrace plazmatického reninu. Kongenní kmeny poskytují možnost definitivně prokázat existenci odpovědných genů na diferenciálních chromozomálních úsecích a detailně zmapovat (lokalizovat) odpovědné geny do krátkých úseků. V takto vymezených chromozomálních úsecích pak je možné se soustředit např. na ty geny, které jsou aktivní ve tkáních významných pro patogenezi hypertenze, jako jsou např. ledviny, a zmenšit tak počet možných kandidátních genů v dané oblasti genomu.
Přenášení experimentálních dat na hypertenzní pacienty není jednoduché pro naši neznalost podobnosti zvířecích modelů s lidskou esenciální hypertenzí. Např. spontánní hypertenze u kmene SHR a lidská esenciální hypertenze mají mnoho společných patofyziologických aspektů, zatím však jde pouze a fenotypickou podobnost. Jsou-li hypertenzní kmeny potkanů adekvátními modely pro studium lidské esenciální hypertenze, bude možné posoudit až po objevení homologních genetických determinant u lidí. Je však velmi nepravděpodobné, že by zvířecí modely detailně napodobovaly tak složitý znak, jako je esenciální hypertenze.
Co lze od experimentálních studií očekávat?
- lepší pochopení patofyziologických procesů,
- srovnání s mapováním odpovědných genů u lidí.
Klinické studie pak budou analyzovat vztah mezi alelami kandidátních genů a biologickými a farmakologickými parametry u pacientů s esenciální hypertenzí. V ideálním případě bude možné přiřadit daným alelám specifické znaky a postupně tak odhalovat faktory přispívající k vývinu esenciální hypertenze (a zlepšit terapii a prevenci tohoto onemocnění).